La expedición quedó al mando del nuevo Piloto mayor del Reino de Castilla, Sebastián Gaboto; partiendo del puerto de San Lúcar de Barrameda en abril de 1526.

Sin embargo, habiendo recorrido las costas del Brasil, naufragó una de sus naves en la isla Santa Catalina. Habiendo debido desembarcar, Gaboto se encontró con varios sobrevivientes de la expedición de Solís a cuyo frente estaba Juan de Garay; los cuales habían convivido con los indígenas. Ellos habían explorado el interior llegando a los territorios del Paraguay; y oído referencias de que existía un territorio rico en oro y plata, al que consideraban que podría llegarse navegando los ríos Paraná y Paraguay. Gaboto optó entonces por abandonar el objetivo de cruzar hacia el Océano Pacífico y dirigirse a explorar los territorios en los que, según esos informes, abundaba la plata, que era uno de los metales más buscados y apreciados en la época.

Gaboto penetró en el estuario del Río de Solís, y en abril de 1527 llegó hasta el puerto de Colonia, donde habiendo desembarcado, se encontró con Francisco del Puerto, el marino sobreviviente de la expedición de Solís que había convivido con los charrúas; motivo por el cual, evocando la figura bíblica del difunto resucitado, bautizó ese puerto como San Lázaro. Luego navegó en el curso del actual Río Uruguay hasta algo al norte de la desembocadura del actual Río Negro.

Un poco al sur de esa desembocadura, en la confluencia del Uruguay con el Río San Salvador — otro afluente del Uruguay al que Gaboto dio ese nombre — sobre la costa oriental, en territorio del actual Departamento de Soriano, los expedicionarios resolvieron construir una fortificación como defensa contra posibles ataques de los indígenas. El Fuerte de San Salvador fue en consecuencia el primer asentamiento fijo de los españoles en el territorio del Río de la Plata.

Dejando en el Fuerte de San Salvador una pequeña guarnición, Gaboto remontó el Río Paraná, estableciendo otra posición fortificada en la confluencia de éste con el Río Carcarañá, a la que llamó Fuerte de Sancti Spiritu. Luego de ello continuó explorando el Río Paraná, en busca de una supuesta Sierra de la Plata; hasta que tropezó con el Salto de Apipé, accidente geográfico existente en el curso del Río Paraná en la región fronteriza entre los territorios de la actual República del Paraguay y la provincia argentina de Corrientes; lo que le obligó a retroceder.

Gaboto continuó sus exploraciones, siempre en busca de la Sierra de la Plata, por el Río Paraguay, en cuyo curso fue atacado por los indios agaces que utilizaban numerosas canoas. La navegacón pudo no obstante continuar hasta la desembocadura de los Ríos Bermejo y Pilcomayo; llegando hasta las proximidades de la actual ubicación de la ciudad de Asunción, donde logró contactarse con los indígenas que, en este caso, se mostraron amigables, aceptando el trueque de diversos objetos de plata y oro a cambio de objetos sin valor como peines y bolitas de vidrio. Eso hizo suponer a Gaboto que finalmente habían llegado a los territorios de la Sierra de la Plata, por lo cual resolvió sustituir el nombre del Río de Solís por el de Río de la Plata.

Vueltos al Fuerte de Sancti Spiritu, Gaboto pudo reunirse con otra expedición española que había partido con igual objetivo de viajar a las Molucas, al mando de Diego García. En la espectativa de obtener grandes riquezas en los territorios del Río Paraná, ambos expedicionarios se unieron para explorar nuevamente ese río; aunque sin obtener esos resultados. Entretanto, los indígenas atacaron los fuertes establecidos por Gaboto en Sancti Spiritu y en San Salvador; por lo cual los expedicionarios resolvieron retornar a España, luego de tres años de infructuosa búsqueda del precioso metal.